吴瑞芳教授谈:HPV亚型病毒载量与子宫颈癌发病的关系——多重荧光PCR的HPV标准化定量技术(硕世HPV检测)的应用研究

作者:吴瑞芳 单位: 来源:中国妇产科在线 编者:
2017-6-1 阅读

【编者按】HPV载量的测定研究在本世纪初就已经开始,但由于HPV定量检测的标准化问题,导致学术界对HPV病毒载量与宫颈病变程度的关系一直存在争议。在第三届CSCCP暨第十四届全国子宫颈癌前病变及子宫颈肿瘤热点研讨会上,北京大学深圳医院吴瑞芳教授为大家讲解了《HPV亚型病毒载量与子宫颈癌发病的关系》,吴瑞芳教授结合HPV标准化定量技术(硕世)在北京大学深圳医院开展的临床研究,揭示了HPV定量检测标准化后,HPV病毒载量与宫颈病变程度呈现了直接的相关性,并提出HPV病毒载量有望成为HPV初筛后二次分流的指标。中国妇产科在线根据其讲课内容进行了整理,供大家学习参考。


吴瑞芳


专家简介

北京大学教授、主任医师,北大博士生导师。系国家级有突出贡献的中青年专家,吴阶平医学研究奖获得者。现任北京大学深圳医院妇产科主任、国家子宫颈癌早诊早治示范基地主任、深圳市女性重大疾病早期诊断重点试验室主任。


HPV感染与宫颈癌的发生密切相关,HPV亚型不同,其致癌性不同。HPV病毒载量与宫颈病变关系的研究结果不一致:一部分学者研究认为宫颈病变严重程度越重,HPV载量越高;另一部分学者研究认为HPV载量与宫颈病变程度不相关。由于宫颈病变与HPV载量存在争议,国内外HPV检测避免病毒量的概念,强调整合状态、癌基因mRNA表达、癌蛋白、HPV亚型等。


HPV病毒感染后,在体内呈整合状态、游离状态及混合状态。Kulmala等研究62例宫颈活组织检查标本中HPV病毒整合状态:CINⅠ/Ⅱ——纯游离状态病毒DNA 的标本 28.6%,混合状态 71.4%,纯整合状态的病毒DNA为 0; CIN Ⅲ——纯游离状态的病毒DNA标本占 7.7%, 混合状态 84. 6%,纯整合状态的病毒DNA 7.7%;SCC——纯游离状态的病毒DNA为 0,混合状态的病毒DNA 33.3%,纯整合状态的病毒DNA 66.7%。Cricca等研究166例HPV16感染的宫颈细胞学标本 HPV病毒整合状态与病毒载量关系密切: LSIL 72例, HSIL 94例,结果:CINⅠ游离状态的病毒DNA 72.2%,游离和整合混合态病毒DNA 27.8%,纯整合状态的病毒DNA为0;CINⅡ/Ⅲ——混合状态病毒DNA 73.5%;子宫颈鳞癌纯整合状态的病毒DNA 81.8%,纯游离状态病毒DNA为0。同时检测病毒载量, CINⅡ/Ⅲ有较高的病毒载量,其游离DNA载量也高于CINⅠ。结论:高病毒载量增加病毒DNA整合入宿主基因组的几率。


HPV载量的相关临床研究


HPV病毒整合状态和病毒载量与病变转归研究: Monnier Benoit等检测38例HPV16病毒载量, 随访18个月,发生CINⅡ/Ⅲ 13例,无病变且HPV阴转 25例。入组时平均病毒载量:阴转组:63拷贝/103细胞,病变组:299拷贝/103细胞,病变组病毒载量明显高于阴转组。随访过程中病毒载量变化:阴转组,随访过程中HPV16 DNA载量不断降低;病变组,CINⅡ/Ⅲ的发生发展与HPV16高病毒载量有密切联系。结论:病毒载量增加使整合态病毒几率增加,促进病变的进展。


宫颈脱落细胞HCⅡ HPV半定量检测: 按检测HR-HPV病毒的RLU/CO值划分为:低载量,1~<10;中载量,≥10~<100; 高载量,≥100。人群筛查HPV病毒载量结果显示:不同级别病变的病毒载量不同(P<0.05),低载量HPV感染所占的比例随宫颈病变级别升高而逐渐降低,高载量HPV感染所占的比例随宫颈病变级别升高而逐渐升高。HR-HPV载量分析:同一级别宫颈病变,HPV载量越高,患病的危险度越高;不同级别宫颈病变,HPV载量越高,患高级别病变的危险度越高。


国内学者关于HPV病毒载量与宫颈病变程度的研究: 对18186例宫颈细胞进行HC2 HPV DNA检测,分析高危型HPV载量与宫颈病变的关系、病毒的高中低载量与宫颈病理关系,结果显示:病毒载量与宫颈病变级别、CIN2+患病率高度相关;高中度病毒载量是CIN2、CIN3和子宫颈癌的主要危险因素;35岁以上女性致病风险更大。


有关HPV病毒感染与宫颈病变关系的多篇文献综述研究结论显示:高危HPV感染50%~90%在两年内被机体清除, HPV感染平均排毒时间8~14个月;10%~20%HPV感染持续两年或以上,30岁以上持续感染增加,持续性感染与机体免疫功能有关。通常,HPV感染后8~10年进展为癌,少数快速进展1~2年。HPV病毒感染与宫颈病变的关系,和是否排毒、HPV感染持续时间、病毒亚型与整合态相关,和病毒载量是否相关,并没有一致的意见。认为HPV病毒载量与宫颈病变严重程度不相关的观点为:HPV不整合、不转录成mRNA,病毒载量再大也不致癌。分析原因为:宫颈病变重,异型鳞状上皮细胞分化差、成熟度低,细胞凋亡坏死,继而HPV病毒丢失,病毒载量随之降低——产生少;CIN的细胞更易脱落,病毒随之被排出体外——排出多;随病变加重整合态病毒增加,整合DNA检测值低,而整合态HPV持续感染病变更易进展——检不出;病变进展由多因素作用:宿主自身免疫状态、HPV易感性环境因素,如长期口服避孕药、多次分娩 、吸烟,合并Ⅱ型单疱病毒、HIV、沙眼衣原体感染及使用免疫抑制剂等。


北京大学深圳医院针对“HPV病毒载量与宫颈病变严重程度研究不一致结果”的问题进行了研究,认为HPV病毒载量研究结果不一致的重要原因——取材的非标准化:针对HPV病毒载量的研究多采用子宫颈脱落细胞作为检测标本,宫颈脱落细胞中有宫颈病变细胞、单纯HPV感染细胞与正常细胞混合存在,且取样方法非标准化,不同个体取到的细胞数差异大,致使检测结果难以准确反映宫颈病变的病毒载量。


因此,采用技术方法要解决以下问题:

1.  取样标本中细胞数量多寡造成的偏差—— 定量检测;

2.  多种成分的细胞混在一起造成的偏差—— 微切准确取材。


研究方法:选择石蜡包埋不同程度宫颈病变组织(CLPE),采用显微微切技术准确获取CLPE中各种程度宫颈病变病灶细胞, 没有非同一级别病变的细胞混杂其中;利用HPV分型/定量平台——江苏硕世生物科技股份有限公司, 采用多重荧光定量PCR技术同步鉴定多种HPV亚型的同时,通过单拷贝基因(看家基因)与待测细胞之间的线性关系获得单位细胞内,HPV病毒亚型的载量——HPV基因拷贝数/每10万细胞;避免了检测样本中细胞数多寡及各种细胞混杂对检测结果的影响,准确检定不同程度宫颈病变病灶中HPV亚型及病毒载量,分析特定亚型病毒载量与不同程度宫颈病变的关系。


江苏硕世生物科技股份有限公司的硕世HPV分型定量检测系统由全自动核酸提取仪、实时荧光定量PCR仪、21种HPV分型定量检测试剂盒、HPV分型定量报告软件组成,利用多重荧光定量PCR技术,检测出13种高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68;5种中危型,HPV26、53、66、73、82;3种低危型,HPV6、11、81。同步报告: HPV分型+HPV载量,细胞单拷贝基 因数测算样本中细胞数,获得同等细胞数中HPV的病毒量。硕世HPV分型定量检测系统是目前唯一 一种HPV分型定量检测方法,获得不同HPV病毒亚型的拷贝数。




硕世HPV分型定量检测实验步骤。


实验步骤:

1、提取DNA;

2、利用江苏硕世生物科技股份有限公司 HPV分型/定量检测试剂盒,对HPV16、52、58、33、31、51、68等亚型病毒载量进行检测。


检测原理:

1、实时荧光PCR技术,病毒基因组L1区为靶区设计亚型特异性引物和探针,在同一反应体系中一次性检测多种亚型HPV病毒及样本细胞数。

2、通过看家基因与待测细胞的线性关系获得HPV亚型在单位细胞内的病毒载量,即单位细胞内的HPV基因拷贝数。


结果:HPV亚型检出率:CIN1 88% ;CIN2/CIN3与宫颈癌100%。不同级别病变HPV亚型:HPV16 CIN3/宫颈癌 85%;CIN2 46%;CIN1  47%:P<0.05。 HPV多重感染:CIN1 47.1% ,CIN2 21.4%;CIN3 50% ;宫颈癌26.7%。


病毒载量:随病变程度增加而升高(P<0.05),亚型频率前三位hpv16、52、58,其载量在hsil>LSIL:P<0.05。结论:病灶组织中hpv16、52、58亚型与宫颈病变密切相关。病变单位细胞内的hpv病毒载量随宫颈病变程度增加而升高。< p="">




通过以上的研究工作,北京大学深圳医院得出结论:


1、采用微切技术准确获取各级别宫颈病变细胞,检测单位细胞内HPV特定亚型的病毒载量,结果表明宫颈病灶中单位细胞内的HPV病毒载量随宫颈病变程度增加而升高,尤其HPV16亚型感染及高病毒载量与宫颈病变进展密切相关。


2、采用新技术进行的HPV病毒载量与宫颈病变程度关系的研究结果与本研究团队既往进行的万例样本标准化取材宫颈脱落细胞HPV半定量检测结果一致。HPV病毒载量与感染亚型相关,与宫颈病变严重程度有直接关系,HPV病毒载量有望成为HPV初筛后二次分流的指标。



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